2.2 HPLC法检测PQQ
本实验首先研究了其他色谱柱检测PQQ,吡咯结果发现普通C18柱无法使PQQ有效保留,喹啉醌产更换流动相甲醇和乙腈,生菌或者是选和梯度洗脱都不能保留PQQ。另外发现改变pH可以使PQQ有所保留,菌种鉴定但峰形较差,吡咯且拖尾严重,喹啉醌产并且不能很好分离样品发酵液中的生菌PQQ。考虑到PQQ极性较大,选和因此采用耐100%水的菌种鉴定COSMOSIL Packed Column 5C18-PAQ反相色谱柱来使PQQ有很好的保留。将准备好的吡咯7个不同浓度的PQQ标准品(100,50,喹啉醌产25,生菌12.5,选和6.125,菌种鉴定5,2.5 mg/L)进行HPLC检测,每个浓度连续进样3次,每次进样20 μ L。结果如图1所示。不同浓度的PQQ均在3.56 min左右出峰。随着PQQ浓度的增加,峰面积也逐渐增加。因此PQQ浓度与峰面积呈正相关的关系。以PQQ浓度为横坐标,色谱峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,线性关系为y=30.27x+7.32,R2=0.9998,说明线性关系良好。采用COSMOSIL Packed Column 5C18-PAQ反相色谱柱检测PQQ,运行时间短,PQQ出峰时间早,检测效率高。本实验建立的HPLC法检测PQQ具有良好的可行性,可作为菌种产PQQ的复筛方法。
2.3菌株的筛选和鉴定
经光谱法初筛,从100多个样品中筛选到50多株PQQ产生菌,大多数的产量在2~5 mg/L,少数可以达到10 mg/L左右,HPLC复筛后其中PQQ产量最高的1株为20.6 mg/L,峰图如图2所示,PQQ在3.57 min出峰,这是未经优化已报道的摇瓶较高产量。
该菌株的菌落在甲醇培养基平板上为乳白色,粘稠的,边缘整齐,直径较小,为1~2 mm。菌体细胞为球状,革兰氏阴性,不产芽孢,有荚膜,无鞭毛。该菌株在以甲醇和甲胺为碳源的培养基中能够良好生长,能利用D-葡萄糖,蔗糖,果糖和木糖。在以铵盐、硝酸盐、牛肉膏、蛋白胨和酵母膏为氮源的培养基中能良好生长。采用PCR技术扩增该菌株的16s rDNA 基因序列,经上海生工测序。通过在 NCBI网站中进行同源性序列搜索及比对,从中选取同源性较高菌株的16s rDNA基因序列,以集团外菌种作对照,通过MEGA软件,用邻接法(Neighbor-Joining)构建系统发育树。结果如图3所示,该菌株与 Methylopila henanensis strain LYBFD3-16A2的同源性最高,为99%。综合菌落及菌体形态特征、16s rDNA序列分析,鉴定该菌株为Methylopila sp.菌株,命名为Methylopila sp.Z1。
2.4 甲醇含量的优化
研究甲醇的不同添加浓度(0.5%,1%,1.5%,2%,2.5%,3%,3.5%,4%)对OD600和PQQ产量的影响,结果如图4所示。在0.5%~2.5%的浓度范围内,随着甲醇体积浓度的提高,菌体OD600和PQQ产量也逐渐提高,当甲醇浓度为2.5%时,OD600和PQQ产量均达到最高,继续增加甲醇浓度,OD600和PQQ产量均有明显下降。这是因为甲醇作为细菌生长的唯一碳源,并且还是细菌细胞甲醇脱氢酶的底物,在其浓度较低时,不足以提供能量使细胞生长,也无法生产过量的PQQ排泄到培养基中,导致PQQ合成效率非常低。当甲醇浓度逐渐提高时,细胞所能利用的碳源增加,菌体OD600和PQQ产量也逐渐增加;当甲醇浓度超过2.5%时,由于甲醇的毒性使细胞损伤,并且底物浓度过高抑制甲醇脱氢酶的活性,导致菌体OD600和PQQ产量下降。因此,2.5%的甲醇体积浓度对于菌体生长和PQQ合成是最佳选择。
3 结论
目前PQQ的检测方法主要有重组酶法,氧化还原法,光谱法和HPLC,其中重组酶法所用到的葡萄糖脱氢酶提取繁琐,纯化过程复杂,且得到的酶活不高,不足以支持大量的菌种筛选;氧化还原法中用到的显色剂氯化硝基四氮唑蓝(NBT)易受培养基中其他成分的干扰,造成阴性结果。光谱法操作简单,检测快速,但也可能受到培养基中具有相似波长吸光度的影响,但本实验采用的是甲醇无机培养基,并通过HPLC检测样品发现,基本没有干扰,因此光谱法作为PQQ产生菌的初筛是高效可行的。本实验还建立了新的HPLC法检测PQQ,采用亲水色谱柱COSMOSIL Packed Column 5C18-PAQ,使得PQQ有很好的保留,并且样品运行时间短,PQQ在3.56 min出峰,出峰时间早,检测时间短,峰形无拖尾,为PQQ检测提供一种新的改进方法。
由于PQQ的生物合成机理没有得到完全阐释,通过基因工程和代谢改造提高PQQ的产量远低于野生菌的产量,因此从环境中筛选具有高产PQQ能力的菌种是十分必要的。本实验从样品中筛选到一株PQQ高产菌,经鉴定为Methylopila sp.属,命名为Methylopila_sp. Z1,未经优化的摇瓶产量达到20.6 mg/L,属于已报道的较高水平。Z1菌株耐受较高甲醇,在培养基甲醇浓度为2.5%时,PQQ产量达26.7 mg/L,相比于初始浓度提高了28%。Z1是一株有高产PQQ潜力的菌株,后续发酵罐培养和优化工艺将进一步提高PQQ产量。
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