油菜(BrassicanapusL.)属于芸薹科(Brassicaceae)芸薹属(Brassica),种高是效准我国主要的油料作物。随着2015年国家油菜籽临时收储政策的确测取消以及国外进口冲击的影响,油菜生产的定油的方比较效益严重下降,在很大程度上影响了我国农民种植油菜的菜中积极性。甘蓝型油菜是维生由甘蓝和白菜经过自然杂交后再加倍后形成的,其两个祖先都是含量深受广大消费者喜欢的可口蔬菜,从起源与进化的种高角度来看,将油菜开发为蔬菜具有良好的效准科学基础和巨大的潜力。近年来在浙江、确测湖北、定油的方湖南、菜中江苏等长江流域主产区,维生因地制宜总结出“菜用+油用”、含量“菜用+花用+油用”等多种油菜高效利用开发模式。种高有研究表明,在适当的种植条件下,收获油菜薹后并不会对油菜籽的产量造成显著影响,此模式可有效增加农民种植油菜的生产效益。在长江流域油菜主产区,油菜作为冬季作物,不会影响到主要粮食作物的种植。利用冬闲田种植油菜,采用油蔬两用技术(即先割菜薹,后收菜籽),对提升油菜种植的整体效益,增加农民收入,促进我国油菜产业发展具有重要意义。
油菜幼苗(5叶期)以及油菜薹中都含有丰富的维生素C以及其它营养物质,具有很高的食用价值。培育高维生素C油菜薹品种,既可提升油菜薹的菜用价值,也可为消费者提供健康营养的功能型蔬菜。维生素C又称为抗坏血酸,是人体必需的主要维生素之一。对于一个普通成年人,人体所需的绝大多数其它维生素膳食推荐供应量都在20mg/d以下,而维生素C的膳食推荐供应量却为100mg/d,是人体中需求量最大的一种维生素,当人体严重缺乏维生素C时会引起坏血病,还会造成人体免疫力的下降。维生素C是蔬菜和水果中最常见的抗氧化剂,参与人体内的多种氧化还原反应。有研究表明,维生素C不仅可以预防癌症,减少癌症的发生率,还可以改善和提高人体的免疫功能,同时具有预防心血管疾病的重要功能。人体自身无法合成维生素C,必须要从新鲜的蔬菜、水果等食物中获取。准确并快速地测定出食物中的维生素C含量,对保证人体日常维生素C的摄取具有重要意义。
目前测定食物中维生素C含量的检测方法主要有:碘酸钾滴定法、荧光法、2,6-二氯靛酚滴定法、紫外分光光度法、高效液相色谱法等,但大多操作繁琐、测定效率不高等问题。在现行标准GB5009.86-2016中规定了高效液相色谱法、荧光法、2,6-二氯靛酚滴定法为测定食品中抗坏血酸的方法,其中2,6-二氯靛酚滴定法,操作简单,但是如果样品中有色素等物质会对滴定结果造成影响;荧光法耗时较长;而高效液相色谱法是一种简单、高效、准确的测定方法。但目前国标中的高效液相色谱法采用的样品前处理比较繁琐,一个样品从处理到上机检测至少需要15min,测定效率不高。在对大群体样本的维生素C进行检测时,如何快速并准确筛选出高维生素C含量材料,提高维生素C检测方法的效率就显得尤为重要。
维生素C是一种水溶性维生素,分子式为C6H8O6,分子中相邻的两个羟基极易发生分解并释放出H+,呈酸性并具有很强的还原性,导致维生素C极其不稳定。况且维生素C在常温条件下易降解,样品的贮藏条件影响检测结果的准确性。为此本研究在国标的基础上优化了测定维生素C的高效液相色谱法,改进后的方法可快速准确地测定样品中维生素C的含量,同时利用液氮贮藏并研磨油菜样品,使得该方法可操作期长、检测结果重复性好、精确灵敏、回收率高,能长期保存,可用于大群体样本中维生素C的分析鉴定及遗传解析,为进一步研究油菜中维生素C的合成和遗传机制奠定了方法基础,有利于培育富含维生素C的油菜新品种。
2018年10月至11月在中国农业科学院油料作物研究所阳逻试验基地所取的油菜幼苗(甘蓝型油菜关联群体材料,取样时期为播种后30d左右)以及小白菜(兔子腿矮脚黄)、生菜(意大利全年耐抽薹生菜)、菠菜(大圆叶菠菜)(每种蔬菜的取样时间均处于可食用状态)。每种油菜选择5株大小相近的材料(去掉油菜的根部和部分黄叶),小白菜、生菜、菠菜同样各取大小相近的5株(去掉蔬菜的根部和部分黄叶)。
高效液相色谱仪(e2695,美国Waters公司)、PDA检测器(2998,美国Waters公司)、色谱柱(C18柱,柱长250nm,内径4.6nm,粒径5μm,美国Waters公司)、瓶口分液器(5-50mL,德国Eppendorf公司)、万分之一天平(JJ124BC,常熟市双杰测试仪器厂)、十万分之一天平(AUW220D,日本岛津公司)、均质机(AD500S-P,上海昂尼仪器有限公司)、超声波清洗机(SB25-12DT,宁波新芝生物科技股份有限公司)、真空抽滤装置(DET-01P,达尔拓公司)、多功能粉碎机(JYS-M01,九阳股份有限公司)。
盐酸(优级纯,国药集团化学试剂有限公司)、超纯水(色谱纯,Rephile-watersystem)、维生素C标准品(纯度99%以上,德国Sigma-Aldrich公司)、乙酸铵(优级纯,德国Sigma-Aldrich公司)、甲醇(色谱纯,美国Fisher公司)。
尼龙66(Nylon)滤膜(直径25mm、孔径0.45μm,天津市津腾实验设备有限公司)、尼龙66(Nylon)滤膜(直径13mm、孔径0.22μm,天津市津腾实验设备有限公司)、微孔水相滤膜(直径50mm、孔径0.25μm,天津市津腾实验设备有限公司)、2mL色谱进样瓶(上海安谱实验科技股份有限公司)、内插管(250μL,上海安谱实验科技股份有限公司)。
提取液(1%HCl溶液)的配制:用移液枪吸取10mL盐酸(优级纯)于1000mL容量瓶中,加超纯水定容,摇匀后备用。
流动相(20mmol/L的乙酸铵):用万分之一的天平称取1.54g乙酸铵,溶解于200mL的超纯水中,超声15min后,再用超纯水定容至1000mL后继续超声脱气15min。超声结束后用真空抽滤泵过微孔水相滤膜(0.22μm)进行抽滤,过滤后的溶液装入流动相瓶中备用。为避免因流动相的原因影响检测结果的准确性,20mmol/L的乙酸铵需现配现用。
维生素C标准溶液(1000μg/mL):用十万分之一的天平准确称取0.1g维生素C标准品于100mL棕色容量瓶中,用1%的盐酸溶解并定容,充分摇匀后放置在4℃冰箱中避光保存。
用万分之一的天平准确称取2g新鲜油菜或蔬菜样品的叶片,置于50mL离心管中,并加入40mL提取液(即1%的HCl),用均质机将样品完全均质破碎。用5mL注射器吸取已均质的样品匀浆,过两层滤膜(0.45μm+0.22μm),滤液过滤到250μL的内插管中,待上机检测。
样品储存:将新鲜油菜或蔬菜样品分别贮藏在4℃、-20℃、液氮(-196℃)条件下。3d后,将贮藏在4℃、-20℃的一部分样品放入液氮中速冻,用多功能粉碎机磨成粉末状(用之前先用液氮进行预冷),并置于50mL离心管中;剩余样品不进行研磨处理,直接称取2g样品,其它处理方法和检测方法相同。测定出不同贮藏条件以及不同处理方式下油菜和蔬菜样品中维生素C的含量。
色谱柱,美国WatersXBridge-C18色谱柱;流动相,甲醇和20mmol/L乙酸铵(两者比例为7:93);流速,1.0mL/min;进样量,10μL;目标柱温,25℃;检测波长,245nm;维生素C的保留时间,2.7min。
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